聚合酶链式反应的原理

聚合酶链式反应已经相对成熟了，那么聚合酶链式反应的原理及功能是什么呢？

聚合酶链式反应是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。

聚合酶链式反应能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，聚合酶链式反应技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。通常需要检查的人群为疑似某种特定的疾病病人，进行分子特异性检查。

聚合酶链式反应一般要在实验室进行，那么聚合酶链式反应的原理和过程什么呢？

聚合酶链式反应就是将聚合酶链式反应反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3端与5端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。

聚合酶链式反应理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。聚合酶链式反应扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为(1+R)^n，R为扩增效率。

聚合酶链式反应这项技术已经相对完善，那么聚合酶链式反应的原理及技术怎么样呢？

聚合酶链式反应的原理就是DNA的半保留复制。聚合酶链式反应反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和聚合酶链式反应产物完全变性，聚合酶链式反应反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。

虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性.最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。

聚合酶链式反应灵敏度是比较高的，那么聚合酶链式反应的原理是什么呢？

聚合酶链式反应的原理是双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

聚合酶链式反应的延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。聚合酶链式反应延伸时间过长又可引起非特异性扩增。