反转录聚合酶链式反应操作过程

反转录聚合酶链式反应操作有一定讲究，那么反转录聚合酶链式反应操作过程什么样呢？

反转录聚合酶链式反应用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反转录聚合酶链式反应大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。

反转录聚合酶链式反应用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。